vijesti

U posljednjoj deceniji, tehnologija sekvenciranja gena se široko koristi u istraživanju raka i kliničkoj praksi, postajući važan alat za otkrivanje molekularnih karakteristika raka. Napredak u molekularnoj dijagnostici i ciljanoj terapiji promovisao je razvoj koncepata precizne terapije tumora i donio velike promjene u cijelo područje dijagnoze i liječenja tumora. Genetsko testiranje može se koristiti za upozoravanje na rizik od raka, usmjeravanje odluka o liječenju i procjenu prognoze, te je važan alat za poboljšanje kliničkih ishoda pacijenata. Ovdje sumiramo nedavne članke objavljene u CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol i drugim časopisima kako bismo pregledali primjenu genetskog testiranja u dijagnozi i liječenju raka.

Somatske mutacije i mutacije germinativne linije. Općenito, rak je uzrokovan mutacijama DNK koje se mogu naslijediti od roditelja (mutacije germinativne linije) ili steći s godinama (somatske mutacije). Mutacije germinativne linije prisutne su od rođenja, a mutator obično nosi mutaciju u DNK svake ćelije u tijelu i može se prenijeti na potomstvo. Somatske mutacije pojedinci stiču u negametskim ćelijama i obično se ne prenose na potomstvo. I germinativne i somatske mutacije mogu uništiti normalnu funkcionalnu aktivnost ćelija i dovesti do maligne transformacije ćelija. Somatske mutacije su ključni pokretač maligniteta i najprediktivniji biomarker u onkologiji; međutim, otprilike 10 do 20 posto pacijenata s tumorom nosi mutacije germinativne linije koje značajno povećavaju rizik od raka, a neke od ovih mutacija su također terapijske.
Mutacija vozača i mutacija putnika. Nisu sve varijante DNK varijante uticale na funkciju ćelije; u prosjeku je potrebno pet do deset genomskih događaja, poznatih kao "mutacije vozača", da bi se pokrenula normalna degeneracija ćelija. Mutacije vozača se često javljaju u genima blisko povezanim sa životnim aktivnostima ćelije, kao što su geni uključeni u regulaciju rasta ćelija, popravak DNK, kontrolu ćelijskog ciklusa i druge životne procese, te imaju potencijal da se koriste kao terapijske mete. Međutim, ukupan broj mutacija u bilo kojem raku je prilično velik, u rasponu od nekoliko hiljada kod nekih karcinoma dojke do više od 100.000 kod nekih visoko varijabilnih karcinoma debelog crijeva i endometrija. Većina mutacija nema ili ima ograničen biološki značaj, čak i ako se mutacija dogodi u kodirajućoj regiji, takvi beznačajni mutacijski događaji nazivaju se "mutacije putnika". Ako genska varijanta u određenom tipu tumora predviđa njegov odgovor na liječenje ili otpornost na njega, varijanta se smatra klinički operabilnom.
Onkogeni i tumor supresorski geni. Geni koji često mutiraju kod raka mogu se grubo podijeliti u dvije kategorije, onkogene i tumor supresorske gene. U normalnim ćelijama, protein koji kodiraju onkogeni uglavnom igra ulogu u promovisanju proliferacije ćelija i inhibiranju apoptoze ćelija, dok je protein koji kodiraju onkosupresorski geni uglavnom odgovoran za negativnu regulaciju ćelijske diobe kako bi se održala normalna funkcija ćelija. U procesu maligne transformacije, genomska mutacija dovodi do pojačanja aktivnosti onkogena i smanjenja ili gubitka aktivnosti onkosupresorskih gena.
Male varijacije i strukturne varijacije. Ovo su dvije glavne vrste mutacija u genomu. Male varijante mijenjaju DNK promjenom, brisanjem ili dodavanjem malog broja baza, uključujući umetanje baza, brisanje, pomicanje okvira čitanja, gubitak start kodona, gubitak stop kodona itd. Strukturne varijacije su veliko preuređenje genoma, koje uključuje segmente gena veličine od nekoliko hiljada baza do većine hromosoma, uključujući promjene broja kopija gena, brisanje hromosoma, duplikaciju, inverziju ili translokaciju. Ove mutacije mogu uzrokovati smanjenje ili poboljšanje funkcije proteina. Pored promjena na nivou pojedinačnih gena, genomski potpisi su također dio izvještaja o kliničkom sekvenciranju. Genomski potpisi mogu se posmatrati kao složeni obrasci malih i/ili strukturnih varijacija, uključujući mutacijsko opterećenje tumora (TMB), mikrosatelitsku nestabilnost (MSI) i homologne rekombinacijske defekte.

Klonske mutacije i subklonske mutacije. Klonske mutacije su prisutne u svim tumorskim ćelijama, prisutne su pri dijagnozi i ostaju prisutne nakon napredovanja liječenja. Stoga, klonske mutacije imaju potencijal da se koriste kao terapijski ciljevi tumora. Subklonske mutacije su prisutne samo u podskupini ćelija raka i mogu se otkriti na početku dijagnoze, ali nestaju s naknadnim recidivom ili se pojavljuju tek nakon liječenja. Heterogenost raka odnosi se na prisustvo više subklonskih mutacija u jednom raku. Važno je napomenuti da su velika većina klinički značajnih pokretačkih mutacija kod svih uobičajenih vrsta raka klonske mutacije i ostaju stabilne tokom progresije raka. Rezistencija, koja je često posredovana subklonovima, možda se ne otkriva u vrijeme dijagnoze, ali se pojavljuje kada se pojavi recidiv nakon liječenja.

Tradicionalna tehnika FISH ili ćelijski kariotip koristi se za otkrivanje promjena na hromosomskom nivou. FISH se može koristiti za otkrivanje genskih fuzija, delecija i amplifikacija i smatra se "zlatnim standardom" za otkrivanje takvih varijanti, s visokom tačnošću i osjetljivošću, ali ograničenim protokom. Kod nekih hematoloških maligniteta, posebno akutne leukemije, kariotipizacija se i dalje koristi za vođenje dijagnoze i prognoze, ali ovu tehniku ​​postepeno zamjenjuju ciljani molekularni testovi kao što su FISH, WGS i NGS.
Promjene u pojedinačnim genima mogu se otkriti PCR-om, i PCR-om u realnom vremenu i digitalnim PCR-om s kapljicama. Ove tehnike imaju visoku osjetljivost, posebno su pogodne za otkrivanje i praćenje malih rezidualnih lezija i mogu dobiti rezultate u relativno kratkom vremenu. Nedostatak je što je raspon detekcije ograničen (obično se detektuju samo mutacije u jednom ili nekoliko gena), a i mogućnost višestrukih testova je ograničena.
Imunohistohemija (IHC) je alat za praćenje zasnovan na proteinima koji se obično koristi za detekciju ekspresije biomarkera kao što su ERBB2 (HER2) i estrogenski receptori. IHC se također može koristiti za detekciju specifičnih mutiranih proteina (kao što je BRAF V600E) i specifičnih genskih fuzija (kao što su ALK fuzije). Prednost IHC-a je što se može lako integrirati u rutinski proces analize tkiva, tako da se može kombinirati s drugim testovima. Osim toga, IHC može pružiti informacije o subcelularnoj lokalizaciji proteina. Nedostaci su ograničena skalabilnost i visoki organizacijski zahtjevi.
Sekvenciranje druge generacije (NGS) NGS koristi tehnike paralelnog sekvenciranja visokog protoka za detekciju varijacija na nivou DNK i/ili RNK. Ova tehnika se može koristiti za sekvenciranje i cijelog genoma (WGS) i genskih regija od interesa. WGS pruža najopsežnije informacije o genomskim mutacijama, ali postoje mnoge prepreke za njegovu kliničku primjenu, uključujući potrebu za svježim uzorcima tumorskog tkiva (WGS još nije pogodan za analizu uzoraka imobiliziranih formalinom) i visoku cijenu.
Ciljano NGS sekvenciranje uključuje sekvenciranje cijelog egzona i panel ciljnih gena. Ovi testovi obogaćuju regije od interesa DNK sondama ili PCR amplifikacijom, čime se ograničava potrebna količina sekvenciranja (cijeli egzom čini 1 do 2 posto genoma, a čak i veliki paneli koji sadrže 500 gena čine samo 0,1 posto genoma). Iako sekvenciranje cijelog egzona dobro funkcionira u tkivima fiksiranim formalinom, njegova cijena ostaje visoka. Kombinacije ciljnih gena su relativno ekonomične i omogućavaju fleksibilnost u odabiru gena koji će se testirati. Osim toga, cirkulirajuća slobodna DNK (cfDNA) pojavljuje se kao nova opcija za genomsku analizu pacijenata oboljelih od raka, poznata kao tečne biopsije. I ćelije raka i normalne ćelije mogu oslobađati DNK u krvotok, a DNK izbačena iz ćelija raka naziva se cirkulirajuća tumorska DNK (ctDNA), koja se može analizirati kako bi se otkrile potencijalne mutacije u tumorskim ćelijama.
Izbor testa zavisi od specifičnog kliničkog problema koji treba riješiti. Većina biomarkera povezanih s odobrenim terapijama može se detektovati FISH, IHC i PCR tehnikama. Ove metode su razumne za detekciju malih količina biomarkera, ali ne poboljšavaju efikasnost detekcije s povećanjem propusnosti, a ako se detektuje previše biomarkera, možda neće biti dovoljno tkiva za detekciju. Kod nekih specifičnih karcinoma, kao što je rak pluća, gdje je teško dobiti uzorke tkiva i postoji više biomarkera za testiranje, korištenje NGS-a je bolji izbor. Zaključno, izbor testa zavisi od broja biomarkera koji se testiraju za svakog pacijenta i broja pacijenata koji se testiraju na biomarker. U nekim slučajevima, upotreba IHC/FISH-a je dovoljna, posebno kada je cilj identificiran, kao što je detekcija estrogenskih receptora, progesteronskih receptora i ERBB2 kod pacijenata s rakom dojke. Ako je potrebno sveobuhvatnije istraživanje genomskih mutacija i potraga za potencijalnim terapijskim ciljevima, NGS je organizovaniji i isplativiji. Osim toga, NGS se može razmotriti u slučajevima kada su rezultati IHC/FISH dvosmisleni ili nejasni.

Različite smjernice daju smjernice o tome koji pacijenti bi trebali ispunjavati uslove za genetsko testiranje. ESMO radna grupa za preciznu medicinu je 2020. godine izdala prve preporuke za NGS testiranje za pacijente s uznapredovalim rakom, preporučujući rutinsko NGS testiranje za uznapredovali neskvamozni nemikrocelularni karcinom pluća, rak prostate, kolorektalni karcinom, rak žučnih kanala i uzorke tumora raka jajnika, a ESMO je 2024. godine ažurirao smjernice na osnovu toga, preporučujući uključivanje raka dojke i rijetkih tumora. Kao što su gastrointestinalni stromalni tumori, sarkomi, karcinomi štitnjače i karcinomi nepoznatog porijekla.
U Kliničkom mišljenju ASCO-a o somatskom testiranju genoma kod pacijenata s metastatskim ili uznapredovalim rakom iz 2022. godine navodi se da ako je terapija povezana s biomarkerom odobrena kod pacijenata s metastatskim ili uznapredovalim solidnim tumorima, za ove pacijente se preporučuje genetsko testiranje. Na primjer, genomsko testiranje treba provesti kod pacijenata s metastatskim melanomom kako bi se otkrile mutacije BRAF V600E, budući da su inhibitori RAF i MEK odobreni za ovu indikaciju. Osim toga, genetsko testiranje treba provesti i ako postoji jasan marker rezistencije na lijek koji će se primijeniti pacijentu. Egfrmab, na primjer, nije učinkovit kod kolorektalnog karcinoma s mutacijom KRAS gena. Prilikom razmatranja pacijentove pogodnosti za sekvenciranje gena, treba integrirati pacijentovo fizičko stanje, komorbiditete i stadij tumora, jer niz koraka potrebnih za sekvenciranje genoma, uključujući pristanak pacijenta, laboratorijsku obradu i analizu rezultata sekvenciranja, zahtijeva da pacijent ima adekvatne fizičke kapacitete i očekivano trajanje života.
Pored somatskih mutacija, neke vrste raka treba testirati i na gene germinativne linije. Testiranje mutacija germinativne linije može utjecati na odluke o liječenju karcinoma kao što su mutacije BRCA1 i BRCA2 kod karcinoma dojke, jajnika, prostate i gušterače. Mutacije germinativne linije također mogu imati implikacije na budući skrining i prevenciju raka kod pacijenata. Pacijenti koji su potencijalno pogodni za testiranje na mutacije germinativne linije moraju ispunjavati određene uvjete, koji uključuju faktore kao što su porodična anamneza raka, dob pri dijagnozi i vrsta raka. Međutim, mnogi pacijenti (do 50%) koji nose patogene mutacije u germinativnoj liniji ne ispunjavaju tradicionalne kriterije za testiranje mutacija germinativne linije na osnovu porodične anamneze. Stoga, kako bi se maksimizirala identifikacija nosioca mutacija, Nacionalna sveobuhvatna mreža za rak (NCCN) preporučuje da se svi ili većina pacijenata s karcinomom dojke, jajnika, endometrija, gušterače, kolorektuma ili prostate testiraju na mutacije germinativne linije.
Što se tiče vremena genetskog testiranja, budući da je velika većina klinički značajnih drajverskih mutacija klonska i relativno stabilna tokom progresije raka, razumno je provesti genetsko testiranje na pacijentima u vrijeme dijagnoze uznapredovalog raka. Za naknadno genetsko testiranje, posebno nakon molekularno ciljane terapije, ctDNK testiranje je povoljnije od DNK tumorskog tkiva, jer DNK krvi može sadržavati DNK iz svih tumorskih lezija, što je pogodnije za dobijanje informacija o heterogenosti tumora.
Analiza ctDNK nakon tretmana može predvidjeti odgovor tumora na tretman i identificirati progresiju bolesti ranije nego standardne metode snimanja. Međutim, protokoli za korištenje ovih podataka za vođenje odluka o liječenju nisu utvrđeni, a analiza ctDNK se ne preporučuje osim u kliničkim ispitivanjima. ctDNK se također može koristiti za procjenu malih rezidualnih lezija nakon radikalne operacije tumora. Testiranje ctDNK nakon operacije je snažan prediktor kasnije progresije bolesti i može pomoći u određivanju hoće li pacijent imati koristi od adjuvantne kemoterapije, ali se i dalje ne preporučuje korištenje ctDNK izvan kliničkih ispitivanja za vođenje odluka o adjuvantnoj kemoterapiji.

Obrada podataka Prvi korak u sekvenciranju genoma je ekstrakcija DNK iz uzoraka pacijenata, priprema biblioteka i generiranje sirovih podataka sekvenciranja. Sirovi podaci zahtijevaju daljnju obradu, uključujući filtriranje podataka niske kvalitete, njihovo poređenje s referentnim genomom, identificiranje različitih vrsta mutacija putem različitih analitičkih algoritama, određivanje utjecaja ovih mutacija na translaciju proteina i filtriranje mutacija germinativne linije.
Anotacija gena vozača osmišljena je kako bi se razlikovale mutacije gena vozača i putnika. Mutacije vozača dovode do gubitka ili pojačanja aktivnosti gena tumor supresora. Male varijante koje dovode do inaktivacije gena tumor supresora uključuju besmislene mutacije, mutacije pomjeranja okvira čitanja i mutacije ključnih mjesta splajsovanja, kao i rjeđe delecije start kodona, delecije stop kodona i širok raspon mutacija insercije/delecije introna. Osim toga, missense mutacije i male mutacije insercije/delecije introna također mogu dovesti do gubitka aktivnosti gena tumor supresora kada utječu na važne funkcionalne domene. Strukturne varijante koje dovode do gubitka aktivnosti gena tumor supresora uključuju djelomičnu ili potpunu deleciju gena i druge genomske varijante koje dovode do uništenja okvira za čitanje gena. Male varijante koje dovode do pojačane funkcije onkogena uključuju missense mutacije i povremene insercije/delecije introna koje ciljaju važne funkcionalne domene proteina. U rijetkim slučajevima, skraćivanje proteina ili mutacije mjesta splajsovanja mogu dovesti do aktivacije onkogena. Strukturne varijacije koje dovode do aktivacije onkogena uključuju fuziju gena, deleciju gena i duplikaciju gena.
Klinička interpretacija genomskih varijacija procjenjuje klinički značaj identifikovanih mutacija, tj. njihovu potencijalnu dijagnostičku, prognostičku ili terapijsku vrijednost. Postoji nekoliko sistema ocjenjivanja zasnovanih na dokazima koji se mogu koristiti za vođenje kliničke interpretacije genomskih varijacija.
Baza podataka precizne medicine onkologije (OncoKB) Centra za rak Memorial Sloan-Kettering klasificira genske varijante u četiri nivoa na osnovu njihove prediktivne vrijednosti za upotrebu lijekova: Nivo 1/2, biomarkeri odobreni od strane FDA ili klinički standardni biomarkeri koji predviđaju odgovor specifične indikacije na odobreni lijek; Nivo 3, biomarkeri odobreni ili neodobreni od strane FDA koji predviđaju odgovor na nove ciljane lijekove koji su pokazali obećavajuće rezultate u kliničkim ispitivanjima, i Nivo 4, biomarkeri koji nisu odobreni od strane FDA koji predviđaju odgovor na nove ciljane lijekove koji su pokazali uvjerljive biološke dokaze u kliničkim ispitivanjima. Dodana je peta podgrupa povezana s otpornošću na liječenje.
Smjernice Američkog društva za molekularnu patologiju (AMP)/Američkog društva za kliničku onkologiju (ASCO)/Koledža američkih patologa (CAP) za tumačenje somatskih varijacija dijele somatske varijacije u četiri kategorije: Stepen I, sa jakim kliničkim značajem; Stepen II, sa potencijalnim kliničkim značajem; Stepen III, klinički značaj nepoznat; Stepen IV, za koji se ne zna da li je klinički značajan. Samo varijante stepena I i II su vrijedne za odluke o liječenju.
ESMO-ova skala kliničke operabilnosti molekularnih ciljeva (ESCAT) klasificira genske varijante u šest nivoa: Nivo I, ciljevi pogodni za rutinsku upotrebu; Faza II, cilj koji se još uvijek proučava, vjerovatno će se koristiti za skrining populacije pacijenata koji bi mogli imati koristi od ciljnog lijeka, ali su potrebni dodatni podaci koji bi to podržali. Stepen III, ciljane genske varijante koje su pokazale kliničku korist kod drugih vrsta raka; Stepen IV, samo ciljane genske varijante podržane predkliničkim dokazima; U stepenu V, postoje dokazi koji podržavaju klinički značaj ciljanja mutacije, ali terapija jednim lijekom protiv cilja ne produžava preživljavanje ili se može usvojiti strategija kombinovanog liječenja; Stepen X, nedostatak kliničke vrijednosti.